Zestaw do PCR w czasie rzeczywistym wirusa Monkeypox

1. PróbkaKolekcja:Próbkę należy pobrać do sterylnych probówek zgodnie z instrukcją

ze standardowymi specyfikacjami technicznymi.

2. Przygotowanie odczynników (obszar przygotowania odczynników)

Wyjmij elementy zestawu, zrównoważ je w temperaturze pokojowej w celu użycia w trybie gotowości.

3. Przetwarzanie próbek (obszar przetwarzania próbek)

3.1 Ekstrakcja kwasu nukleinowego

Zaleca się pobieranie próbek płynnych o objętości 200 µl, kontroli dodatniej i kontroli ujemnej do ekstrakcji kwasów nukleinowych, zgodnie z odpowiednimi wymaganiami i procedurami zestawów do ekstrakcji wirusowego DNA.

3.2 Rozpuszczanie liofilizowanego proszku i dodawanie matrycy

Przygotować liofilizowany premiks wirusa ospy małpiej w zależności od liczby próbek.Na jedną próbkę potrzebna jest jedna probówka PCR zawierająca liofilizowany proszek premiksu.Kontrolę ujemną i kontrolę dodatnią należy traktować jak dwie próbki.

(1) Dodać 15 µl roztworu rozpuszczającego do każdej probówki PCR zawierającej liofilizowany premiks, następnie dodać odpowiednio 5 µl wyekstrahowanych próbek/kontroli negatywnej/kontroli pozytywnej do każdej probówki PCR.

(2) Szczelnie zamknij probówki PCR, potrząśnij probówkami PCR ręcznie, aż liofilizowany proszek całkowicie się rozpuści i wymiesza, zbierz płyn na dno probówek PCR poprzez natychmiastowe wirowanie przy niskiej prędkości.

(3) Jeśli do wykrywania używasz zwykłego instrumentu do PCR w czasie rzeczywistym, następnie bezpośrednio przenieś probówki do PCR do obszaru amplifikacji;jeśli do wykrywania używasz BTK-8, wykonaj następujące czynności: przenieś 10 μL płynu z probówki PCR do studzienki na chip reakcyjny BTK-8.Jedna probówka PCR odpowiada jednej studzience na chipie.Podczas pipetowania należy upewnić się, że pipeta jest ustawiona pod kątem 90 stopni w pionie.Końcówki pipet z barierą aerozolową należy umieścić na środku studzienki z umiarkowaną siłą i przestać popychać pipetę po osiągnięciu pierwszego biegu (aby uniknąć pęcherzyków).Po napełnieniu dołków należy wyjąć membranę z chipem reakcyjnym, aby przykryć wszystkie dołki, a następnie chip przenieść do obszaru detekcji amplifikacji.

4. Amplifikacja PCR (obszar detekcji)

4.1 Umieść probówki/chip reakcyjny PCR w zbiorniku reakcyjnym i wprowadź nazwy poszczególnych studzienek reakcyjnych w odpowiedniej kolejności.

4.2 Ustawienia fluorescencji detekcji: (1) wirus ospy małp (FAM);(2) Kontrola wewnętrzna (CY5).

4.3 Uruchom następujący protokół rowerowy

Protokół ABI7500, Bio-Rad CFX96, SLAN-96S, QuantStudio:

 Protokół BTK-8:

5. Analiza wyników (proszę zapoznać się z instrukcją obsługi urządzenia)

Po reakcji wyniki zostaną zapisane automatycznie.Kliknij „Analizuj”, aby przeprowadzić analizę, a przyrząd automatycznie zinterpretuje wartości Ct każdej próbki w kolumnie wyników.Wyniki kontroli negatywnej i pozytywnej powinny być zgodne z poniższym „6. Kontrola jakości”.

6. Kontrola jakości

6.1 Kontrola ujemna: Brak Ct lub Ct>40 w kanale FAM, Ct≤40 w kanale CY5 z normalną krzywą wzmocnienia.

6.2 Kontrola dodatnia: Ct≤35 w kanale FAM z normalną krzywą amplifikacji, Ct≤40 w kanale CY5 z normalną krzywą amplifikacji.

6.3 Wynik jest ważny, jeżeli spełnione są wszystkie powyższe kryteria.W przeciwnym razie wynik jest nieważny.

Interpretacja wyniku

Możliwe są następujące wyniki:

NOTATKA: W przypadku uzyskania nieprawidłowego wyniku należy pobrać próbkę i ponownie ją przetestować.